简易单细胞挑取法
制备后壁磨口毛细滴管。从玻璃管中选择一段,确定想要拉细的位置,并放到火焰上方,之后在其尖端使用钳子夹紧,将玻璃管拉伸成为极细的毛细管。并寻找合适的位置进行切割,为了确保管口更具平整性和光滑性,可以使用砂轮或者砂纸打磨。
准备分离室。将保湿剂水琼脂加入含无菌水的培养皿内。待其凝固以后,在37℃的恒温箱内进行倒置,开展数小时的烘干工作,保证有干燥的皿盖。
制备萌发孢子悬液。1.制备孢子悬液:将取有米曲霉孢子的接种环连同装有查氏培养液和玻璃珠的三角瓶进行连接,并进行5~10分钟的振荡工作,确保能够完全分散孢子。2.过滤:在过滤上述孢子液时,可以借助漏斗或者自制的过滤装置,并对过滤的液体进行收集。3.孢子萌发:在对孢子的浓度进行检测时,可以通过借助血球计数板检测孢子过滤液,之后使用查氏培养液对孢子液每毫升含有的孢子个数进行调整,之后在28℃环境条件下静置培养8个小时。4.点样:萌发的孢子液,需要使用自制的后壁磨口毛细滴管进行少量的吸取,并在培养皿内部的方格中,进行点样,点样要快速轻巧。每一点样的面积,不能超过显微镜低倍镜的视野,之后在各个方格中将萌发孢子液进行点样处理,使其形成一个个分离室。然后,迅速地翻转该皿盖,盖住原有的平板。5.镜检:在显微镜镜台上放上经过分离的点样小室,并对皿盖内部上的每个微滴使用低倍镜进行检查。6.加薄片培养基:薄层平板的制作方式主要为,无菌培养皿中放入适量的查氏琼脂,等成为凝固状态以后,把琼脂用小刀片切割成多个小片,之后在镜检中记录的单孢子微滴上放置一个小片,其他琼脂小片和微滴与上述步骤相同,然后将皿盖盖上。7.培养:在温度为28℃的环境条件下,把分离小室平板静置24个小时,等到单孢子变为微菌落以后,即可进行下一步操作。8.转种:将形成的微菌落琼脂薄片,使用微型小刀取下,并将其转移到装有新查氏培养基的斜面处或者液体当中,并在28℃环境条件下,进行4~7小时的培养,就可以得到一个经过单孢子发育最终长成的一个纯培养基。
稀释涂布平板法
倒平板。加热,使肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁琼脂培养基熔化,等其温度降至55~60℃时,将数滴10 酚溶液滴进高氏I号琼脂培养基中,并将链霉素溶液倒入马丁琼脂培养基当中,将其混合均匀以后,倒入平板。
稀释液的制备。在含有玻璃珠的三角烧瓶中倒入一定量的无菌水,并加入适量的样品,进行20分钟的振荡摇匀,确保样品和水分之间实现充分融合,细胞发生分散。之后用无菌吸管吸出一定量的悬浮液,并放入有无菌水的试管当中,使二者均匀混合。从该试管中再吸取一定量的液体,放入到另一个装有无菌水的试管当中,不断重复,最终得到稀释浓度各不相同的6种溶液。
涂布。将最后3个稀释浓度量分别记录到3个培养基的底部,之后使用吸管对3种稀释液进行吸取,并对应滴入各自的平板,使用玻璃涂棒对其进行刮动,使稀释液在培养基上能够均匀地被涂布,并在室温环境中放置5~10分钟,确保培养基能够吸附住菌液。
培养。在室内温度为28℃的环境条件下,倒置高氏I号培养基、马丁培养基,对菌液进行培养,时间大约为3~5天。同时在室内温度为37℃的环境条件下,培养肉膏蛋白胨2~3天,也呈现倒置状态。
(射洪市人民医院)